详情

 HILIC方法学是一个强大的工具，特别适用于分析极性化合物，但实施起来可能很具挑战性，并且有几个重要的因素需要注意，以避免常见的缺陷。 本文将介绍HILIC技术，讨论常见的问题领域，并帮助您成功地将HILIC方法整合到您的实验室中。

“HILIC”代表亲水相互作用液相色谱。 它是一种使用极性固定相的分离模式，可以是裸硅胶，如Raptor HILIC-Si色谱柱，也可以是极性键合相，如Raptor FluoroPhenyl色谱柱。HILIC方法中使用的溶剂类似于反相LC中使用的溶剂（例如水，甲醇和乙腈），也可以使用挥发性缓冲剂和改性剂。 因为HILIC固定相是极性的，所以该技术非常适合分析在C8和C18等典型反转相上保留有限或无保留的极性分子。

 HILIC有时也被称为“反向反相”，因为在此水是“强”洗脱溶剂或溶剂，与反相LC中水是“弱”溶剂相反（图1）。在HILIC分离中，初始条件是高有机相（通常为60％或更多），并且水层被吸附在二氧化硅表面上。这种会在流动相中形成的水层的存在有时被描述为梯度，因为当它接近二氧化硅表面时，它会逐渐富含水分。由于它们可溶于水层，因此极性分析物可与极性颗粒表面相互作用，并以多种方式保留，包括氢键合，取向力和离子交换。 例如，Raptor HILIC-Si色谱柱可提供离子交换和分配的良好组合，与其他HILIC型相比，可实现更多的选择性和保留。

色谱柱活化和再平衡对于保留时间重现性至关重要

确保HILIC方法成功的步是了解分析柱必须在使用前进行适当活化，并且在进样之间充分平衡。 如果不能在两次运行之间活化并平衡色谱柱，则可能导致水层无法在颗粒表面*重新建立，从而导致保留时间不可重复。为了在使用前活化色谱柱，必须使用分析过程中将使用的流动相进行冲洗。对于等度HILIC方法，应使用至少50个色谱柱体积，对于梯度HILIC方法，应至少*运行10次空白样。 当您改变流动相组成或任何添加剂的浓度时，也需要活化。与次活化色谱柱时一样，使用相同数量的色谱柱体积或空白进样。除了使用流动相对色谱柱进行初始活化外，重要的是色谱柱在进样之间重新平衡。 由于HILIC方法中的分离机理涉及在颗粒表面上吸附水层，因此在注入之间*重新建立或“重置”该水层以确保保留时间重现性是非常重要的。 我们建议在梯度程序返回初始条件或等度分离时开始至少10个柱体积的平衡，从后一个峰的保留时间开始至少10个柱体积。 *重新平衡所需的色谱柱体积数量可能非常依赖于分析物，尤其是等度分离时，所以请确保您研究HILIC方法开发过程中的保留时间重现性。表I列出了Raptor HILIC-Si色谱柱各个尺寸的色谱柱体积。活化时，乘以的50等度方法以确定所需活化溶剂的总体积，然后除以流量计算总活化时间。 为了平衡，对于所需的平衡体积，将表中对应于色谱柱尺寸的值乘以10; 然后除以流量计算方法程序中的平衡时间间隔。

例如，使用100 mm x 2.1 mm内径色谱柱时，一个色谱柱体积为0.2 mL。 如果我们运行流速为0.30 mL/min的等度方法， 那么色谱柱应至少用10 mL（50×0.2 mL）活化，总活化时间为33分钟（10mL÷0.30 mL/min）。同样，每次进样之间重新平衡的体积为2mL（10×0.2mL），再平衡时间为7分钟（2 mL÷0.30 mL/min）。这些计算可用于确定一个良好的起点，但重新平衡时间与分析物有关，因此需要开发方法以确保重新平衡充分，并导致可重现的保留时间。

样品溶剂匹配对于良好的峰形是至关重要的

如果您有使用反相分离的经验，您会知道，如果样品溶剂与色谱流动相有很大差异，则峰形会有很大差异。在HILIC方法中也是如此，因此样品溶剂尽可能匹配有机物含量高的初始流动相是非常重要的。好消息是，如果您正在使用SPE进行样品制备，您将在高度有机溶剂中进行洗脱，因此样品提取物可能已经准备好进行HILIC分析。图2显示了溶剂匹配对峰形的影响。如果样品是100％水溶液，敌草快的峰形差，两种化合物洗脱快，信号相对较低，而样品溶于流动相B（75％乙腈）。通过将注射溶剂与初始流动相条件相匹配，您可以获得更好的峰形，更高的保留率和更高的灵敏度。

流动相pH值影响依赖于分析物

流动相除了需要与样品溶剂匹配外，流动相的pH值也会影响色谱性能。事实上，方法开发和评估在这方面为重要， 因为pH对分析物电荷状态的影响因各化合物的pKa而异。使用HILIC方法时，流动相中高浓度的有机溶剂会提高pH值， 实际的洗脱液pH值可能比单独使用含水部分高1-1.5个单位。色谱柱本身的电荷状态也会受到影响。例如，在Raptor HILIC-Si色谱柱中，裸二氧化硅的pKa介于3.8和4.5之间，因此流动相pH会改变二氧化硅表面的电荷，使其在pH值接近3.8及以上，非常酸性及离子化（带负电）的条件下呈中性。因此，如果您的分析物含有一个或多个质子化的胺或季胺基团，则它是使用Raptor HILIC-Si色谱柱分析的理想选择。

缓冲液选择影响色谱和仪器性能

缓冲液用于保持洗脱液的pH恒定，并且还可以帮助将目标分析物与干扰物分离。许多HILIC分离使用质谱检测器，因此挥发性缓冲液如甲酸铵和乙酸铵应用非常普遍。由于两个主要原因，HILIC分离中的缓冲液浓度很重要。首先，流动相的高有机物含量会导致缓冲盐沉淀在自动进样器和色谱柱之间，色谱柱熔块过滤上或色谱柱中。所有这些情况都可能导致您的仪器进行停机维护。第二个考虑因素特别涉及发生在Raptor HILIC-Si色谱柱中的保留机制。回想一下，在典型的HILIC流动相条件下，二氧化硅表面具有负电荷，因此带正电荷的缓冲离子与目标分析物竞争保留。如果缓冲液浓度较高，则可以降低分析物的保留时间。与pH一样，需要优化方法，但10 mM是缓冲液浓度的良好起点。 A和B两种流动相均应进行均匀缓冲，以保持梯度中的离子强度恒定，以获得一致的质谱检测器响应。请向您的MS供应商咨询他们用于ESI源的大缓冲液浓度。

结论

与任何新技术一样，能否成功的应用在很大程度上取决于是否理解新方法和更熟悉的程序之间的差异。 HILIC方法为分析极性化合物提供了一种强大的新方法，但如果分析人员认为其与反相LC相似，则实施可能具有挑战性。 使用HILIC方法，确保色谱柱的正确活化（无论是使用新柱，还是溶剂或添加剂改变时），再就是在进样之间重新平衡; 将样品溶剂与初始流动相匹配; 并了解流动相pH和缓冲液的选择对分析的影响是取得良好结果的重要步骤。 这些指南为建立HILIC方法提供了一个很好的起点，但方法开发对于确保您的特定目标分析物具有优异性能至关重要。