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一  复苏 传代

（1） 准备

   无菌超净台，酒精灯，75%酒精喷壶，二氧化碳培养箱，37℃水浴锅，离心机；培养瓶，含10%胎牛血清的*培养基和基础培养基以及PBS磷酸缓冲液（提前放置超净台使平衡到室温），无菌工作服（白大褂），口罩，手套，记号笔

（2） 步骤

   1.穿好无菌工作服，带上口罩和手套，快速从液氮里取出冻存管，快速放进37℃水浴锅缓慢摇晃使细胞解冻，注意冻存管的封口膜不要破裂，防止污染。

   2.解冻后用纸擦干冻存管表面的水滴，酒精喷壶喷洒适量75%酒精消毒冻存管封口处。

   3.开超净台，点燃酒精灯燃烧片刻后（可提前准备），冻存管放超净台，换新手套，小心打开冻存管，避免污染，无菌吸管将1ml细胞全部吸出至5ml无菌EP管，补加9ml基础培养基稀释，1000rpm，离心5min使细胞沉淀，弃上清。

   4.加入新鲜配制的含10%血清的培养基4ml，轻轻混匀，用吸管将细胞移至25T培养瓶。

   5.平躺放置培养瓶，8字形混匀后，置于37℃，5%二氧化碳培养箱培养。

   6.培养24小时后，显微镜观察细胞（贴壁细胞）贴壁后，小心更换培养基，根据不同细胞的生长状态进行传代培养，培养瓶上标记：操作者，时间，细胞类型。

   7.有的实验员的培养基会加入抗生素防止细胞污染，但是这对于掌握细胞培养是非常不利的，不加抗生素培养细胞更能提醒实验者无菌操作的意识。一旦细胞出现污染，易于发现，一旦发现污染的细胞应立刻煮沸丢弃，以免污染同实验室其他细胞。

   8.细胞长满90%-100%即可传代，小心打开培养瓶，瓶口过酒精灯消毒，弃培养基。

   9.加入1mlPBS，润洗细胞，重复3次，弃PBS。

   10.加入4ml*培养基，用无菌吸管小心吹打贴壁细胞或者用消化细胞使细胞脱落。

   11.转移1/2脱落的细胞至新的培养瓶，各瓶补加*培养基至4ml。

   12.小心封口，平躺放置培养瓶，8字形混匀后，置于37℃，5%二氧化碳培养箱培养。

   13.待长满后，按同样的方法传代培养。

二  冻存

当不需要使用细胞或者细胞量足够时，可以将细胞冻存起来，供以后实验用

（1） 准备

    细胞冻存液（20%血清、10%DMSO、70%基础培养液），梯度降温盒

（2） 步骤

        1.选取活力好，密度约70%细胞用于冻存，此时细胞处于对数生，用于冻存。

        2 .细胞吹打或者消化后，转移至无菌EP管，1000rpm里面5min。

        3.弃上清，加入新鲜配制的细胞冻存液，25T细胞可以加入2ml细胞冻存液，分装2个冻存管，细胞密度为5106-1107个每ml。

        4.做好标记，放入梯度降温盒（提前平衡至室温）。

        5.将梯度降温盒放入-80℃冰箱过夜，第二天取出冻存管，快速放入液氮保存。

遵循“快速复苏，缓慢冻存”的原则。