数字PCR系统是一种基于单分子PCR方法的核酸定量技术,它将传统的PCR扩增与微流控技术相结合,通过分割样品为数千至数万个微滴,每个微滴包含或不包含目标DNA分子,从而实现绝对定量。以下是对数字PCR系统的详细介绍:
技术原理:
数字PCR系统的核心工作原理包括微滴生成、PCR扩增、荧光信号检测和数据分析四个步骤:
微滴生成:通过微流控技术将PCR反应液分割为大量微小的液滴,每个液滴中只包含一个或零个目标DNA分子。
PCR扩增:对液滴进行PCR扩增,目标DNA分子在液滴中进行指数级增长。
荧光信号检测:在扩增过程中,通过荧光信号检测每个液滴中的荧光信号强度,从而判断液滴中是否存在目标DNA分子。
数据分析:通过数据分析软件对荧光信号进行统计,计算出目标DNA分子的绝对数量。
高灵敏度与准确度:能够检测到极低浓度的目标分子,其检测极限可达百万分之一甚至更低,特别适用于稀有突变检测、拷贝数变异分析等。同时,由于直接对单个分子进行计数,定量结果更加准确可靠。
绝对定量:不需要标准品(或标准曲线)即可实现靶分子的绝对定量,直接读出样本的拷贝数目,简化了实验流程并提高了结果的准确度。
多重反应能力:可以在单个PCR反应中同时检测多种核酸序列,提高了实验效率和准确性。
闭管设计:采用闭管设计,PCR反应结束后无需开盖检测,有效避免了气溶胶污染,确保了检测结果的准确性。
对抑制剂和污染物的耐受性高:能够在复杂的环境中进行稳定的PCR扩增,适用于基质复杂的样本中的核酸定量分析。
数字PCR系统在多个领域具有广泛的应用价值:
遗传病诊断:用于检测基因突变、基因拷贝数变异等,为遗传病的精准诊断提供有力支持。
肿瘤研究:可检测肿瘤组织中的基因表达水平、基因突变等,为肿瘤的早期诊断、预后判断和个体化治疗提供重要依据。
病原体检测:具有高灵敏度,可检测低拷贝数的病原体DNA或RNA,有助于提高病原体检测的准确性和可靠性。
基因编辑与表达分析:在基因编辑、基因表达分析、基因分型等领域展现出广阔的应用前景。
其他领域:还适用于单细胞分析、表观遗传学研究、疾病超早期分子检查等。